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Volume de comunicações da natureza

Nature Communications volume 13, Número do artigo: 3013 (2022) Citar este artigo

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A hipertensão pulmonar é uma doença rara fatal que causa insuficiência cardíaca direita por elevação da resistência arterial pulmonar. Há uma necessidade médica não atendida de desenvolvimento de terapêuticas com foco no remodelamento vascular pulmonar. Lipídios bioativos produzidos por células inflamatórias perivasculares podem modular o remodelamento vascular. Aqui, mostramos que epóxidos derivados de ácidos graxos ω-3 (epóxidos ω-3) liberados de mastócitos por PAF-AH2, uma fosfolipase A2 seletiva de fosfolipídeo oxidado, regulam negativamente a hipertensão pulmonar. A deleção genética de Pafah2 em camundongos acelera a remodelação vascular, resultando na exacerbação da hipertensão pulmonar hipóxica. O tratamento com epóxidos ω-3 suprime a ativação dos fibroblastos pulmonares pela inibição da sinalização do TGF-β. A suplementação in vivo com epóxidos ω-3 atenua a progressão da hipertensão pulmonar em vários modelos animais. Além disso, o sequenciamento completo do exoma para pacientes com hipertensão arterial pulmonar identifica duas variantes patogênicas candidatas de Pafah2. Nossos achados sustentam que o eixo de produção de epóxido PAF-AH2-ω-3 pode ser um alvo terapêutico promissor para a hipertensão pulmonar.

A hipertensão arterial pulmonar (HAP) é uma doença rara e fatal que causa estenose da artéria pulmonar idiopática, que leva ao aumento da pressão da artéria pulmonar e essa sobrecarga de pressão crônica acaba resultando em insuficiência cardíaca direita e morte. A hipertensão pulmonar (HP) é caracterizada por alterações teciduais irreversíveis, conhecidas como "remodelamento vascular pulmonar", envolvendo células endoteliais da artéria pulmonar, células musculares lisas e fibroblastos1,2. Embora as terapias disponíveis para HP tenham melhorado notavelmente a sobrevida dos pacientes com HAP3, uma parcela significativa dos pacientes não atinge a eficácia esperada. Portanto, medicamentos que podem suprimir o remodelamento vascular pulmonar e reduzir a progressão da doença são considerados uma necessidade médica não atendida que pode potencialmente aumentar a sobrevida do paciente4.

As células inflamatórias desempenham um papel importante na remodelação tecidual. Na remodelação vascular pulmonar, vários tipos de células inflamatórias presentes no tecido pulmonar produzem fatores humorais, como citocinas e quimiocinas, que controlam as alterações do tecido vascular1,2,5. Além disso, os mediadores lipídicos também são produzidos por células inflamatórias locais e esses mediadores regulam a inflamação, formação de trombos, angiogênese e fibrose, os quais podem acelerar a remodelação vascular6,7. De fato, tem sido demonstrado que lipídios funcionais pró-inflamatórios, como prostanóides e leucotrienos, contribuem para a patogênese da HP8,9,10. Por outro lado, os ácidos graxos ω-3, principalmente o ácido eicosapentaenóico (EPA) e o ácido docosahexaenóico (DHA), são conhecidos por desempenhar um papel bioprotetor, e alguns de seus derivados possuem funções únicas, que podem suprimir a remodelação tecidual6 ,11,12,13. Usando um modelo de remodelação cardíaca induzida por sobrecarga de pressão, nosso relatório anterior demonstrou que metabólitos EPA liberados por macrófagos suprimiam a ativação anormal de fibroblastos cardíacos e mantinham a homeostase tecidual14. Portanto, espera-se que os ácidos graxos ω-3 e seus derivados também suprimam a remodelação vascular pulmonar na HP, mas isso ainda precisa ser determinado.

Aqui, por uma análise lipidômica abrangente de amostras de pulmão com HP e análise fenotípica de camundongos knock-out (KO) do fator ativador de plaquetas acetil-hidrolase tipo II (PAF-AH2), uma enzima produtora de epóxido ω-3 a partir de fosfolipídios de membrana, revelamos que os ácidos graxos ω-3 epoxidados possuem um anel éter de 3 membros (epóxidos ω-3; 17,18-EpETE e 19,20-EpDPE) como mediadores lipídicos funcionais envolvidos na patogênese da HP. Os epóxidos ômega-3 foram constantemente produzidos a partir de mastócitos no pulmão para suprimir a ativação anormal de fibroblastos adventícios e exibiram efeitos terapêuticos na HP mesmo quando administrados externamente. Também encontramos mutações patogênicas de PAF-AH2 em pacientes com HAP que não responderam adequadamente à terapêutica atual, sugerindo que o epóxido ω-3 pode ser um alvo terapêutico valioso para HAP.

T and p.Gln184Arg (Q184R)/c.551A>G, which were presumed to be highly pathogenic from three PAH patients (Supplementary Table 2). These SNPs had high Combined Annotation Dependent Depletion (CADD) scores that indicated high pathogenicity. Also, these variants were found at a site different from the catalytic sites of Pafah2 (Fig. 6a). Using the homology model of PAF-AH2 proteins as the initial model, simulated PAF-AH2 p.R85C and PAF-AH2 p.Q184R variants were shown to have conformational changes compared to the native protein (Fig. 6b). Furthermore, we examined the impacts of the Pafah2 variants by expressing the mutant proteins using pcDNA vectors in vitro. The levels of the mutant proteins, PAF-AH2 p.R85C and p.Q184R, were significantly reduced relative to those of the native PAF-AH2, but the level of PAF-AH2 S236C, a variant at the catalytic site, was unchanged (Fig. 6c). Interestingly, treatment with MG132, a proteasome inhibitor, partially recovered the protein levels of PAF-AH2 p.R85C and p.Q184R (Fig. 6c), suggesting that the protein degradation was due to the ubiquitin proteasome system. Taken together, the Pafah2 p.R85C and p.Q184R variants found in PAH patients were considered to contribute to the progression of PH by enhancing the vulnerability of the PAF-AH2 protein to degradation./p>30; SIFT, deleterious; Polyphen; probably damaging) from whole-exome sequencing data in PAH patients. Most patients with these mutations were poorly responsive to existing therapeutic agents, primarily vasodilators. Additionally, experiments using the expression vector in cultured cells revealed reduced expressed protein level associated with the two mutations. The forced expression of PAF-AH2 in BMMC was attempted with the plasmid vector but was unsuccessful. Therefore, HEK293 cells, which are human-derived cells that produce a sufficient amount of target protein via transfection of plasmid vector and had low endogenous production of PAF-AH2 protein, were selected as transfected cells. Since treatment with a proteasome inhibitor restores the levels of the mutant proteins, we believe that post-translational modifications such as ubiquitination are involved in the reduction due to mutations. In future, a knock-in mouse of human PAF-AH2 harboring these mutations should be generated to determine if PH would naturally develop or show exacerbation./p>95% of the floating cells were confirmed to be Kit+ FcεRI+ mast cells by flow cytometry. Degranulation of BMMCs was evaluated by the amounts of released β-HEX in an enzymatic assay using 4-nitrophenyl N-acetyl-β-glucosaminide./p>T), Q184R (551A>G), and S236C (707C>G) and confirmed the presence of mutations by DNA sequencing. Native or mutant Pafah2 pcDNA plasmids (3.5 μg per 6-well dish) were transfected into HEK293 cells using Lipofectamine 2000 (Invitrogen). After 48 h, the culture medium was changed and exposed DMEM with or without MG132 (10 μM) for 6 h. Subsequently, cells were collected and the amount of expressed PAF-AH2 protein was analyzed by western blotting. HEK293 cells transfected by empty pcDNA vectors were used as controls./p>